Wstęp

Wirusowe gorączki krwotoczne (VHFs – viral heamorrhagic fevers) są odzwierzęcymi chorobami zakaźnymi wywołanymi przez wirusy RNA należące do czterech rodzin: Filoviridae, Flaviviridae, Arenaviridae i Bunyaviridae. Przedstawicielami tej grupy patogenów są wirusy: Ebola (EBOV), Marburg (MARV), żółtej febry (YFV), gorączki Zachodniego Nilu (WNV), gorączki dengue (DENV), gorączki Lassa (LASV), argentyńskiej gorączki krwotocznej Junín (JUNV), Machupo (BHFV), Sabiá (BzHFV), Guanarito (VHFV), gorączki doliny Rift (RVFV), gorączki krymsko-kongijskiej (CCHFV), gorączki krwotocznej z zespołem nerkowym (hantawirusy), niedawno rozpoznany wirus Alkhumara (ALKV) i inne. VHFs należą do najcięższych chorób człowieka. Ich cechą charakterystyczną – i zwykle dominującą – jest skaza krwotoczna (hemorrhagic diathesis), o złożonej patogenezie (uszkodzenie drobnych naczyń krwionośnych, małopłytkowość, zespół rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC – disseminate intravascular clotting). Współczynnik śmiertelności w przypadku niektórych EBOV może wynosić nawet 50-90% (Geisbert i wsp. 2010). Według CDC do maja 2011 r. odnotowano około 2 300 przypadków zakażeń wirusem Ebola (z czego 1 957 zgonów, śmiertelność ok. 85 %), a do listopada 2010 r. 449 przypadków zakażeń wirusem Marburg (z czego 368 zgonów, śmiertelność 82 %). Według WHO corocznie rejestruje się na świecie ok. 200 000 przypadków żółtej gorączki (z czego 30 000 przypadków jest śmiertelnych), a tylko w 2007 r. w obu Amerykach zgłoszono ponad 890 000 przypadków zakażeń wirusem dengue. Wirusowe gorączki krwotoczne występują najczęściej w Afryce, południowo-wschodniej Azji i Ameryce Południowej. Tylko CCHFV i hantawirusy mają swoje naturalne ogniska w Europie. Istnieje jednak niebezpieczeństwo zawleczenia chorób do Ameryki i Europy, w tym Polski przez turystów, imigrantów lub wektory (Mirski i wsp. 2011). Do chwili obecnej nie opracowano zadowalających metod leczenia ani skutecznej, swoistej profilaktyki szczepionkowej VHFs, z wyjątkiem żółtej febry. Stosuje się zazwyczaj intensywne leczenie objawowe i podtrzymujące, w warunkach pełnej ochrony personelu medycznego (Woodrow i wsp. 2007). Brak specyficznych leków, możliwość transmisji choroby z człowieka na człowieka, niebezpieczeństwo wykorzystania VHFVs jako broni biologicznej lub czynnika bioterroryzmu sprawiają, że poszukiwanie nowych strategii leczenia i swoistej profilaktyki tych chorób staje się pilną koniecznością (Borio 2011). Badania, jak to przedstawiamy, są bardzo intensywne i wykorzystują współczesne możliwości wirusologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej.

1. Substancje przeciwwirusowe pochodzenia naturalnego

W ostatnich latach przedmiotem zainteresowania naukowców stały się preparaty pochodzenia roślinnego. Między innymi prowadzono badania (Talarico i wsp. 2005) nad dwoma bogatymi w grupy siarczanowe polisacharydami uzyskanymi z brazylijskich krasnorostów Gymnogongrus griffithsie i Cryptonemia crenulata pod kątem ich właściwości przeciwwirusowych wobec czterech serotypów wirusa dengue. Wspomniane preparaty hamowały namnażanie się wirusa DENV-2 w komórkach Vero, wykazując słabszą aktywność wobec DENV-3 i DENV-4 i brak działania na DENV-1. Aktywność przeciwwirusową wykazano na komórkach hepatoma HepG2, napletkowych fibroblastach PH i komórkach Vero, z wyjątkiem komórek owadzich C6/36 HT. Testowane związki działały w początkowych etapach infekcji, tj. na adsorpcję i internalizację wirusa, przy czym na efekt przeciwwirusowy miały wpływ rodzaj użytych komórek oraz serotyp wirusa. Ponieważ przypuszczano, że w wiązaniu się wirusa z powierzchnią komórek gospodarza biorą udział wysoko siarczanowane cząsteczki siarczanu heparanu, skupiono się na związkach przypominających swoją budową ten wysoko anionowy związek (Talarico i wsp. 2005).

Innymi siarczanowymi związkami pochodzenia naturalnego zajmowali się Ono i wsp. (2003). Dwa galaktomannany, jeden wyekstrahowany z nasion Minosa scabrella (stosunek mannozy do galaktozy 1,1) i drugi – otrzymany z nasion Leucaena leucocephala (stosunek mannozy do galaktozy 1,4) poddano modyfikacjom polegającym na dołączeniu grup siarczanowych i przebadano je pod kątem aktywności wobec wirusów żółtej gorączki oraz dengue. W badaniach na zakażonych myszach oraz komórkach C6/36 wykazano, że hamowały one skutecznie adsorpcję wirusów na powierzchni komórek. Również zastosowanie dużych dawek wiążących mannozę chimerycznych lektyn dają nadzieję na skuteczniejsze zwalczanie zakażeń wirusem Ebola (Michelow i wsp. 2010).

Jain i wsp. (2008) porównali aktywność rutynowo stosowanej w leczeniu gorączek krwotocznych rybawiryny z ekstraktem z liści rokitnika zwyczajnego (Hippophaë rhamnoides) wobec DENV-2. Wyciąg wywierał ochronny wpływ na makrofagi oraz wykazywał istotne działanie immunomodulacyjne.

Pod kątem aktywności przeciwwirusowej badano także południowoamerykańskie liany (Reis i wsp. 2008), wśród nich Uncaria tomentosa używaną przez amazońskich Indian w celach leczniczych już od czasów starożytnych. Jej właściwości immunomodulacyjne, przeciwzapalne, cytotoksyczne i antyoksydacyjne były przedmiotem licznych badań (Heitzmam i wsp. 2005, Valente 2008, Reis i wsp. 2008). Czynniki zapalne wydzielane w dużej ilości przez monocyty u pacjentów z gorączką dengue o ciężkim przebiegu, zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych, przyczyniając się do wystąpienia postaci wstrząsowej choroby. Przy użyciu cytometrii przepływowej zbadano wpływ wspomnianych ekstraktów z liany na monocyty zakażone DENV, który wyrażał się przez redukcję liczby zakażonych komórek. Stwierdzono także wpływ ekstraktów na uwalnianie cytokin oraz silne działanie immunosupresyjne.

Liu i wsp. (2007) otrzymali z chińskiego ziela Alternathera philoxcroides wyciąg określony jako ekstrakt nr 1, z którego po dalszej obróbce uzyskali ekstrakt nr 2, zidentyfikowany jako kwas oleanolowy. Uzyskany kolejno ekstrakt nr 3 zawierał betainy a ekstrakt nr 4 okazał się 5-oksoproliną. Wszystkie ekstrakty przebadano w kierunku aktywności wobec trzech szczepów wirusa Haantan (114, 435 oraz A9). Wykazano, że wszystkie preparaty hamowały namnażanie się wirusów na komórkach Vero-E6, przy czym najbardziej aktywny okazał się ekstrakt nr 1 (IC₅₀ wyniosło 153 μg/ml). Prawdopodobnie wynika ze współdziałania wszystkich składników ekstraktu. W badaniach na oseskach myszy obserwowano, że procent ich przeżywalności przy dawce 2,5 μg/ml, podanej po 3, 10 i 14 dniach od momentu zakażenia wirusem

wynosił odpowiednio 75 %, 50 % i 0, co wskazuje, że wcześnie podjęte leczenie skuteczniej hamuje rozwój infekcji.

Wpływ olejków eterycznych uzyskanych z Lippia alba, Lippia origanoides, Artemisia vulgaris i Oreganum vulgare na replikację wirusa żółtej gorączki zbadali Meneses i wsp. (2009). Hamująca aktywność preparatów była widoczna, gdy wirus inkubowano z olejkami lotnymi 24 h przed zakażeniem komórek Vero, przy czym, gdy komórki traktowano olejkami tuż przed infekcją nie obserwowano takiego działania. Sądzi się, że działanie olejków eterycznych spowodowane jest bezpośrednią inaktywacją wirusa, co może być efektem niszczenia otoczki wirusowej przez związki lipofilowe. Głównymi składnikami olejków eterycznych testowanych w badaniach były: karwon, karwakrol, limonen i tymol. Dalsze badania zmierzają do wyjaśnienia mechanizmu działania wspomnianych związków na wirusy.

2. Preparaty syntetyczne

Jedynym chemioterapeutykiem stosowanym rutynowo w terapii gorączek krwotocznych  jest analog guanozyny – rybawiryna (1β-D-rybofuranozylo-1H-1,2,4-triazolo-3-karboksamid), której skuteczność została potwierdzona w przypadku gorączek Lassa, CCHF, Junín, Machupo, częściowo dla gorączki doliny Rift, Zachdniego Nilu. Rybawiryna nie zawsze jednak jest skuteczna, zwłaszcza w zaawansowanym stadium choroby, poza tym nie działa na wirusy Ebola i Marburg, a ponadto wywoływać może skutki uboczne. Candurra i wsp. (1996) badali leki psychotropowe: trifluoperazynę i chloropromazynę pod kątem ich wpływu na replikację arenawirusów: Junín, Tacaribe oraz Pichinde. W testach in vitro wykazano, że oba wymienione związki w koncentracjach nietoksycznych dla komórek działały hamująco na namnażanie się wirusów, przy czym chloropromazyna oddziaływała na wczesne etapy replikacji wirusów, a trifluoperazyna poza blokowaniem wnikania wirusów do komórek wpływała też negatywnie na proces dojrzewania wirionów. Badania z wykorzystaniem immunofluorescencji wykazały ponadto jej wpływ na dystrybucję cząstek wirusowych na powierzchni komórek.

Badano aktywność przeciwwirusową N-arylowanych puryn, a wśród nich N1-3-fluorofenyloinozyny (FPI) i N1-3- fluorofenylohipoksantyny (FP-Hx) wobec hantawirusów (Chung i wsp. 2009). W doświadczeniach na komórkach Vero-E6 najbardziej aktywna okazała się FPI. Ponieważ nie stwierdzono wpływu preparatu na zmniejszenie ilości wirusowego RNA ani na zwiększenie częstotliwości występowania w nim mutacji, sądzi się, że aktywność antywirusowa preparatu może wynikać z poreplikacyjnej interakcji FPI z białkami wirusa bądź gospodarza, wpływającej na ilość uwalnianych wirionów. Poszukiwanie związków o budowie podobnej do FPI jest celowe i może być pożyteczne.

Bray i wsp. (2002) badali wpływ 3- deazaadenozyny i 3-deazaneplanocyny A, analogów adenozyny na zakażone wirusem Ebola myszy. Pojedyncza dawka preparatów podana tuż po infekcji zapobiegała rozwojowi choroby u zwierząt a efekt ochronny związany był ze znacznie zwiększoną pod wpływem preparatu produkcją interferonu α. Zdolność tego typu związków do blokowania zarówno wirusów DNA jak i RNA jest związana z inhibicją enzymu komórkowego, tj. hydrolazy S-adenozylohomocysteinowej, poprzez redukcję metylacji struktury cap wirusowego mRNA. Dalsze badania nad tymi związkami, pozwolą na szczegółowe określenie mechanizmu ich aktywności przeciwwirusowej u naczelnych.

Wykazano, że wiele analogów adenozyny posiada zdolność hamowania replikacji wirusa Ebola, prawdopodobnie dzięki blokowaniu komórkowej hydrolazy S-adenozylo-L-homocysteinowej, co powoduje pośrednio ograniczenie metylacji czapeczki na końcu 5’ wirusowego mRNA. Zaobserwowano, że podawanie myszom przez 9 dni jednego z analogów adenozyny w dawce 2,2-20 mg/kg chroniło te zwierzęta przed zakażeniem (Bray i wsp. 2000). Stwierdzono ponadto, że jednorazowe podanie wybranych analogów w dawce 80 mg/kg lub 1mg/kg w pierwszej lub drugiej dobie od zakażenia dało najlepsze efekty terapeutyczne, wyrażające się aż 1000-krotnym obniżeniem wiremii. Analogi adenozyny okazały się skuteczne w ograniczaniu rozwoju choroby, chociaż nie hamowały jej całkowicie.

Ostatnio odkryto rodzinę małych cząsteczek, które selektywnie hamują pośredniczące w infekcji komórek ludzkich glikoproteiny (GP) wirusów Ebola i Marburg (Yermolina i wsp. 2011). Wykorzystując chimeryczny wirus HIV-Ebola, posiadający płaszcz białkowy wirusa Ebola, przebadano ich aktywność przeciwwirusową. Związek określony jako 8a okazał się specyficznym inhibitorem wejścia wirusa Ebola i Marburg (IC₅₀ = 30 μΜ) do komórek gospodarza, przy czym pochodne tego związku wykazywały jeszcze wyższą aktywność przeciwwirusową.

Wirus krymsko-kongijskiej gorączki krwotocznej (CCHFV) jest występującym w Europie patogenem wywołującym zachorowania o wysokim współczynniku śmiertelności. Simon i wsp. (2006) zbadali wpływ NO, który u zwierząt pełni istotną rolę w nieswoistych wrodzonych mechanizmach immunologicznych, na zakażenie CCHFV. Zastosowanie donora tlenku azotu – S-nitrozo-N-acetylo-penicylaminy (SNAP) wpływało na redukcję liczby potomnych wirionów o 99 % względem kontroli dzięki hamowaniu ekspresji niektórych genów wirusowych a także obniżeniu koncentracji wirusowego RNA w zakażonych hodowlach. Użycie związku SIN-1, donora nadtlenoazotynu, nie miało jednak istotnego działania przeciwwirusowego, co wskazuje na konieczność dalszej selekcji związków o właściwościach podobnych do SNAP.

Barrientos i wsp. (2003) badali wpływ cyanowiryny-N (CV-N) pod kątem aktywności przeciwwirusowej wobec EBOV. Cyanowiryna dodana do zakażonej hodowli komórkowej hamowała rozwój efektu cytopatycznego wirusa, a zastosowana u myszy opóźniała śmierć zakażonych zwierząt. Mechanizm działania CV-N polega przypuszczalnie na wiązaniu się do powierzchni glikoproteiny otoczkowej wirusa, tj. GP_1,2 , pośredniczącej w wejściu wirusa do komórki.

Badany przez Amana i wsp. (2009) małocząsteczkowy związek chemiczny FGI-106 wykazywał zdolność do hamowania namnażania się wirusów Ebola, doliny Rift oraz dengue in vitro poprzez wpływ na replikację wirusa Ebola oraz innych, nawet odległych genetycznie wirusów. Szerokie spektrum aktywności związku obserwowanej zarówno na komórkach mysich i zwierząt naczelnych sugeruje, że działanie FGI-106 jest związane z oddziaływaniem na konserwatywne mechanizmy gospodarza, które są istotne dla wirusa. Dalsze badania pozwolą na poznanie molekularnych mechanizmów aktywności przeciwwirusowej FGI-106 i określenie możliwości jego klinicznego zastosowania (Aman i wsp. 2009).

Bouloy i wsp. (2009) wykazali, że pirazynokarboksyamid T-705 w zależności od dawki działał hamująco na RFV. Enzymy komórek gospodarza (kinazy) konwertują T-705 do T-705RTP, który hamuje wirusową zależna od RNA polimerazę RNA. W doświadczeniach in vitro preparat okazał się aktywny także wobec JUNV, wykazując przy tym znacznie mniejszą cytotoksyczność od rybawiryny.

Badano aktywność przeciwko wirusowi Junín heterocyklicznych związków azotowych, pochodnych imidazotiazoli (związków posiadających aktywność fungicydów, herbicydów, a także wykazujących właściwości przeciwnowotworowe), zsyntetyzowanych przez zamianę podstawników i ich położenia w pierścieniu heterocyklicznym (Barradas i wsp. 2011). Spośród dwunastu przebadanych związków dwa wykazały aktywność przeciw JUNV na komórkach Vero wyższą od rybawiryny. Kolejne modyfikacje sprzyjały zwiększeniu aktywności przeciwwirusowej związków, która wyrażała się najpełniej przy jednoczesnym dodaniu do hodowli komórkowej z wirusem.

Podjęto próby określenia znaczenia białek szoku cieplnego 90 (Hsp90) dla replikacji wirusa Ebola (Smith i wsp. 2010). Czaperony, czyli białka opiekuńcze są istotnym czynnikiem wpływającym na replikację wirusów RNA o ujemnej polarności (w przypadku wirusów polio białko Hsp90 jest konieczne do właściwego składania białek kapsydu oraz kontroli funkcji wirusowej polimerazy paramyksowirusów i buniawirusów). Podjęto próby zbadania inhibitorów Hsp90,  zarówno naturalnych jak i syntetycznych: geldanamycynę, radicicol, 17-allylamino-17-demetoksygeldanamycynę (17-AAG; analog geldanamycyny) oraz nowej klasy związki benzamidowe: AV-1, AV-2, AV-3 i AV-81 w celu określenia ich wpływu na replikację wirusa EBOV. Stwierdzono, że każdy z przebadanych związków posiadał zdolność hamowania replikacji wirusa, przy czym najbardziej efektywne okazały się analogi benzamidu AV 1-3. Inhibitory czaperonu Hsp90 mogą być przełomem w poszukiwaniu nowych strategii hamowania zakażeń wirusowych.

Siarczanowe glikozaminoglikany, takie jak heparyna, hamują wczesne etapy infekcji wirusem dengue dzięki interakcji z białkiem otoczkowym wirusa. Kato i wsp. (2010) stwierdzili, że również siarczan chondroityny E (ale nie siarczan chondroityny D) skutecznie hamował adsorpcję wirusa na powierzchni komórek BHK-21 i Vero, co sugerowało, że wspólne węglowodorowe determinanty tych związków mogły mieć kluczowe znaczenie dla hamowania zakażenia wirusem dengue. Ponieważ rekombinowane białko otoczkowe łączyło się wybiórczo w testach z heparyną i siarczanem chondroityny E, można wnioskować, że specyficzna struktura węglowodorowa jest bardziej istotna dla aktywności przeciwwirusowej niż ilość ujemnie naładowanych grup siarczanowych (Kato i wsp 2010). Glikozaminoglikany są nierozgałęzionymi siarczanowanymi polisacharydami występującymi w dużej ilości na powierzchni komórek. Wyróżnia się wśród nich pięć postaci izomerycznych tj.: heparynę, siarczan heparanu, siarczan chondroityny, siarczan dermatanu i siarczan keratanu. Mają one istotne znaczenie dla wzrostu komórek, utrzymania ich integralności i wzajemnej komunikacji. Glikozaminoglikany o wysokim stopniu usiarczanowania, jak heparyna i siarczan chondroityny hamują infekcyjność filowirusów, co może mieć związek ze stopniem ich usiarczanowienia. Wyniki badań Kato i wsp. (2010) mogą jednak świadczyć o tym, że większe znaczenie w mechanizmie hamowania ma struktura węglowodorowa tych związków.

Przebadano aktywność pochodnych akrydonu wobec różnych szczepów wirusów Junín oraz dengue (Sepúlweda i wsp. 2008). Występujące w naturze i syntetyczne pochodne akrydonu wykazują znaną od dawna aktywność biologiczną (stwierdzono m.in. ich działanie przeciwko wirusom HIV, Epsteina-Barra i opryszczki pospolitej). Spośród przebadanych in vitro związków dwie pochodne N-alliloakrydonu (3c i 3f) były aktywne przeciwko JUNV (szczep IV4454) i DENV-2 (szczep NGC), przy czym efekt przeciwwirusowy był najlepszy gdy związki podawano do hodowli komórek Vero jednocześnie z wirusem. Powyższe wyniki zachęcają do dalszych badań nad przeciwwirusowym działaniem pochodnych akrydonu.

3. Immunomodulatory:

Arbidol jest małą, indolo-pochodna cząsteczką, odkrytą i zastosowaną po raz pierwszy w Rosji w leczeniu i profilaktyce grypy oraz innych chorób układu oddechowego. W badaniach na oseskach myszy BALB/c zakażonych wirusem Haantan wykazano, że arbidol zwiększał istotnie procent przeżywalności i wydłużał czas życia zwierząt, w porównaniu z kontrolą, wpływając także na obniżenie miana wirusa (Deng i wsp. 2009). Mechanizm działania arbidolu polega na pobudzeniu produkcji interferonu oraz hamowaniu fuzji wirusów otoczkowych z błoną komórkową.

Wyniki badań in vitro na komórkach Vero i MRC-5 wykazały, że arbidol blokuje wczesne etapy namnażania się wirusa Chikungunya (CHIKV) (Delogu i wsp. 2011). W celu dokładniejszego poznania mechanizmu działania preparatu użyto ARB-opornych mutantów tego wirusa. Poprzez sekwencjonowanie zlokalizowano mutacje w genie białka otoczki wirusa E2 – G407R w regionie, który może być istotny u alfawirusów dla interakcji z receptorami komórkowymi. Dla potwierdzenia roli tych mutacji w molekularnym mechanizmie oporności na ARB zaprojektowano klon posiadający te same mutacje. Badania in vitro wykazały, że arbidol interferuje we wczesnej fazie infekcji wirusa (etapy adsorpcji wirusa lub jego wnikania). Podanie preparatu przed infekcją znacznie redukowało miano wirusa, podczas gdy wprowadzenie preparatu do hodowli po infekcji nie miało wpływu na zbiór wirusa. ARB wykazuje szerokie spektrum działania przeciwwirusowego, zarówno wobec wirusów otoczkowych jak i bezotoczkowych. Badania in vitro na modelu HCV wykazały, że działanie arbidolu jest związane z hamowaniem zmian konformacyjnych glikoproteiny niezbędnej do fuzji błonowej. Z kolei w przypadku wirusa grypy hamował on wejście wirusa do komórek poprzez destabilizację hemaglutyniny i blokowanie endosomalnej fuzji błonowej (Delogu i wsp. 2011).

4. Szczepionki:

Ze względu na antygenowe zróżnicowanie czynników etiologicznych gorączek krwotocznych uzyskanie uniwersalnej, skutecznej szczepionki nawet w ramach poszczególnych rodzin RNA wirusów jest bardzo trudne. W związku z tym prowadzone są badania nad szczepionkami chroniącymi przed poszczególnymi serotypami/genotypami wybranych wirusów. Maves i wsp. (2011) do otrzymania szczepionki przeciwko serotypowi 1 (DENV-1) użyli do inaktywacji wirusa psoralenów, tj. fotoaktywnych związków, które z łatwością przenikają przez dwuwartwę stanowiącą otoczkę lipidową wirusa, interkalują między pirymidynami i łączą je pod wpływem światła UVA, dzięki czemu inaktywowanie wirusa odbywa się bez naruszania struktur powierzchniowych epitopów. Przygotowany w ten sposób szczep WestPac 74 DENV-1 użyto do szczepienia małp Aotus nancymaae. U wszystkich immunizowanych zwierząt wykryto obecność przeciwciał przeciw DENV i mimo, że po zakażeniu u immunizowanych zwierząt stwierdzono wiremię u 3 z 7 małp, to czas jej trwania uległ skróceniu (z 3,67 dnia do 0,71 dnia).

Gorączka doliny Rift, charakteryzująca się wysokim współczynnikiem śmiertelności u płodów i noworodków, występuje u bydła, kóz, owiec, wielbłądów (powodując duże straty ekonomiczne) oraz u ludzi. Jest ona jedną z najczęściej występujących zoonoz na kontynencie afrykańskim. Dla celów profilaktycznych podejmowano badania nad szczepionkami atenuowanymi lub inaktywowanymi formaliną. Tak np. inaktywowany szczep Smithburn okazał się wysoce immunogenny, ale u bydła w ciąży i owiec wykazywał działanie teratogenne. Szczepionka Clone 13, będąca atenuowanym izolatem łagodnego szczepu uzyskanego od chorego człowieka z Afryki oraz MP12, będący atenuowanym izolatem egipskim ZH548, dały obiecujące wyniki na zwierzętach (Näslund i wsp. 2009), dzięki czemu MP12 mógł przejść do drugiej fazy badań klinicznych. Szczepionki, zawierające inaktywowany formaliną RVFV nie zostały zarejestrowane i są niedostępne komercyjnie (dostępne są jedynie dla lekarzy weterynarii zatrudnionych na terenach endemicznych, pracowników laboratoriów i innych osób z grup wysokiego ryzyka). Szczepionki inaktywowane są drogie, trudne w produkcji, wymagają użycia większych dawek w porównaniu do szczepionek atenuowanych oraz corocznych szczepień przypominających w celu utrzymania odpowiedniego poziomu odporności (Mandel i wsp. 2010).

Rao i wsp. (1999) badali możliwość indukowania cytotoksycznych limfocytów T (CTLs) u myszy poprzez zakażanie ich napromieniowanym wirusem Ebola lub tym samym wirusem zamkniętym w liposomach, zawierających lipid A. Wykazano, że dożylna immunizacja myszy może indukować CTL, jednak przy zastosowaniu samych napromieniowanych wirusów efekt nie był tak trwały jak po podaniu wirusów zawartych w liposomach. Wykrycie aktywności liposomowego lipidu A jako adiuwanta do indukcji pamięci odpowiedzi CTL i identyfikacja epitopów na C-końcu wirusowej GP jest obiecującym podejściem w rozwoju szczepionek przeciwko zakażeniom wirusem Ebola.

Inną strategią przy opracowywaniu szczepionek przeciw gorączkom krwotocznym jest wykorzystanie cząsteczek przypominających wirusy (VLPs – virus like particles). Ekspresja rekombinowanych wirusowych białek strukturalnych prowadzi do otrzymania VLPs, nie zawierających materiału genetycznego wirusa. VLPs mogą być produkowane na różnych typach hodowli komórkowych, zarówno na liniach komórkowych ssaków, owadów, roślin czy też w drożdżach. Cząsteczki te morfologicznie podobne są do dzikiego typu wirusa, prezentując antygeny wirusowe w natywnej konformacji, dzięki czemu są łatwo rozpoznawane przez system immunologiczny organizmu (Sun i wsp. 2006, Yang i wsp. 2008).

Badano skuteczność VLPs produkowanych w komórkach owadzich przy użyciu ekspresyjnych systemów bakulowirusowych (Sun i wsp. 2009). Wykazano, że podwójna immunizacja myszy 50 μg Ebola-VLPs indukowała produkcję wysokiego poziomu przeciwciał przeciw Ebola GP, zapewniając kompletną ochronę zwierząt przed zakażeniem. Ustalono ponadto, że dzięki  dodaniu adjuwantu dawka szczepionki Ebola-VLP może być znacząco zmniejszona dając taki sam poziom ochrony przed infekcją. Näslund i wsp. (2009) wykorzystali produkowane w komórkach ssaczych VLPs, którymi trzykrotnie immunizowano myszy, uzyskując wysokie miana przeciwciał, chroniących je przed letalną dawką wirusa gorączki doliny Rift. Szczepienie z użyciem VLPs efektywnie hamowało replikację wirusa RVF, nie powodując przy tym efektów ubocznych .Wartość chimerycznej wirusopodobnej cząsteczki zawierającej glikoproteinę G_N i G_C wirusa doliny Rift i proteinę gag wirusa białaczki mysiej Moloneya (MoMuLV) badali Mandel i wsp. (2010), którzy dla oceny efektywności szczepionki opartej na RVF-VLPs posłużyli się dwoma modelami zwierzęcymi. Immunizowane myszy były częściowo chronione przed infekcją, podczas gdy szczepione szczury były całkowicie odporne na śmiertelną dawkę wirusa RVF. Przyjęta strategia z wykorzystaniem VLPs może być ważnym krokiem w znalezieniu skutecznych metod zwalczania zakażeń wirusami gorączek krwotocznych (Sun i wsp. 2009).

Podejmowane są również próby wykorzystania rekombinowanych szczepionek przeciwko wirusowi Marburg (MARV). Uzyskano, np. rekombinowaną szczepionkę zapewniającą ochronę zwierząt przed angolskim szczepem Musoke, opartą na wirusie opryszczkowego zapalenia jamy ustnej (VSV), z ,,wmontowanym” genem kodującym glikoproteinę szczepu Musoke MARV. Daddario-DiCaprio i wsp. (2006) sprawdzili skuteczność tej szczepionki na małpach zakażonych dwoma szczepami MARV: tj.  Musoke i Ravn. Uodpornione i zakażone zwierzęta nie wykazały żadnych objawów chorobowych, co potwierdziło możliwość użycia tego typu szczepionki w walce z różnymi szczepami wirusa Marburg.

Feldman i wsp. (2007) badali skuteczność rekombinowanej szczepionki, opartej na wektorze wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, która dawała ekspresję glikoproteiny wirusa Ebola. Badania przeprowadzone na świnkach morskich, myszach i małpach wykazały, że przeżywalność świnek morskich, którym podano szczepionkę 24 h po infekcji wynosiła 50 % a myszy – 100 %. Gdy szczepionkę podano małpom 20-30 min po infekcji uzyskano 50% efekt ochronny. Dalsze badania mogą okazać się obiecującą strategią w zwalczaniu zakażeń filowirusami.

Geisbert i wsp. (2010) badali wartość rekombinowanej szczepionki, opartej na VSV, kodującym glikoproteinę (GP) wirusa Marburg. Po podaniu jej małpom 24 h po infekcji śmiertelną dawką wirusa, 5 z 6 zwierząt przeżyło, a gdy szczepionkę podano 48 h po infekcji 1/3 zwierząt była chroniona.

Wykazano (Hensley i wsp. 2010), że szczepionka zaprojektowana przeciw dwóm szczepom Ebola (Zaire EBOV i Sudan EBOV) chroniła małpy nie tylko przed wspomnianymi szczepami, ale także była skuteczna wobec nowo zidentyfikowanego gatunku wirusa, tj. Bundibugyo (BEBOV). Przyjęta strategia immunizacji zwana ,,prime-boost”, polegała na tym, że zwierzęta pierwszy raz szczepiono DNA kodującym glikoproteiny wirusa EBOV (szczepów Zaire i Sudan), a po roku immunizowano je ponownie szczepionką opartą na rekombinowanym adenowirusie, kodującym glikoproteinę powierzchniową wirusa Zaire EBOV. Gdy po drugiej immunizacji zwierzęta poddano zakażeniu letalną dawką wirusa, żadne z nich nie wykazywało oznak choroby, podczas gdy zwierzęta nie szczepione zachorowały. U immunizowanych zwierząt stwierdzono silną odpowiedzią komórkową i humoralną przeciw GP ZEBOV i komórkową przeciw BEBOV GP, mimo że szczepionka nie zawierała w swoim składzie antygenów przeciwko temu szczepowi wirusa Ebola, co zachęca do prowadzenia dalszych badań w tym kierunku.

Stosowana od ponad 70 lat szczepionka zawierająca żywy atenuowany wirus żółtej gorączki, jest uważana za jedną z najbardziej skutecznych i bezpiecznych szczepionek. Pojedyncza dawka nadaje długoterminową odporność (ok. 10 lat). Jednak ze względu na występowanie objawów niepożądanych (szczególnie u osób z obniżoną odpornością, osób po 60 roku życia, dzieci do 6 miesiąca, osób z HIV, co jest barierą dla ochrony przeciw żółtej febrze na terenach endemicznych, gdzie zakażenie HIV jest bardzo rozpowszechnione), np. reakcję nadwrażliwości pojawiająca się u osób wrażliwych na składniki szczepionki, chorobę neurotropową (YEL-AND) oraz YEL-AVD, poszukiwanie nowych rozwiązań profilaktycznych jest pilną koniecznością (Hayes i wsp. 2010). Monach i wsp. (2011) badali wartość inaktywowanej szczepionki, zawierającej wirus 17D żółtej gorączki namnożony na komórkach Vero i inaktywowany za pomocą β-propiolaktonu. Szczepionkę przebadano na 60 zdrowych osobnikach w wieku od 18 do 49 lat. Jedna z badanych grup otrzymała szczepionkę w dawce 0,48 μg, a druga 4,8 μg, przy czym szczepienie powtórzono po 21 dniach. Wyniki badań wykazały, że szczepionka indukowała pojawienie się przeciwciał neutralizujących u 100% badanych, którzy otrzymali 4,8 μg antygenu w każdym wstrzyknięciu i 88% u pacjentów otrzymujących 0,48 μg antygenu w każdym wstrzyknięciu. W obu badanych grupach wystąpiły trzy zdarzenia niepożądane, tj. łagodny ból, tkliwość i świąd w miejscu wstrzyknięcia, a jeden przypadek pokrzywki odnotowano w trzecim dniu po drugiej dawce 4,8 μg. Powyższe wyniki wskazują, że szczepionka zawierająca inaktywowany antygen z adiuwantem ałunu może być bezpieczniejszą alternatywą dla żywej atenuowanej szczepionki 17D.

Obecnie trwają na świecie intensywne prace nad uzyskaniem szczepionek przeciw poszczególnym genotypom hantawirusów.  W Korei Południowej  stosowana jest powszechnie, także w armii, żywa atentowana szczepionka przeciwko serotypowi Hantaan („Hantavax”) o wysokiej, potwierdzonej w kontrolowanych badaniach klinicznych skuteczności (Park i wsp. 2004). Istnieją ponadto skuteczne szczepionki przeciw argentyńskiej i boliwijskiej VHFs.

W Bułgarii, w grupach ryzyka stosuje się szczepionkę własnej produkcji przeciw CCHF. 

5. Inne możliwości:

Do zapobiegania gorączkom krwotocznym użyto małego, interferującego RNA (siRNA), zdolnego do hamowania ekspresji genów i replikacji wirusów (Geisbert i wsp. 2006). Przy wyborze tego rodzaju terapii zasadnicze trudności wiążą się ze sposobem dostarczania siRNA do komórek docelowych in vivo, co rozwiązano stosując SNALPs, tj. siRNA przyłączony do specjalnych liposomów, tworzących kwasowo-lipidowe cząstki. Dla sprawdzenia, czy siRNA hamuje replikację wirusa ZEBOV in vitro dokonano transfekcji na komórkach Vero pulą 4 różnych siRNAs, specyficznych dla genu L (kodującego polimerazę) wirusa ZEBOV. Transfekowane komórki zakażono następnie po 0 h, 24 h i 48 h wirusem, przy czym po 24 h zebrano płyn znad hodowli i określono miano wirusa. W zależności od czasu transfekcji i infekcji siRNA hamowało produkcję wirionów ZEBOV od 2 do 10 razy. Eksperymenty na świnkach morskich wykazały, że siRNA dostarczone za pośrednictwem PEI (siRNAs zmieszany z polietylenaminą) na krótko przed infekcją wirusem obniżało poziom wiremii i częściowo chroniło te zwierzęta przed śmiercią. Najbardziej efektywne okazało się użycie siRNA dostarczanego dzięki SNALPs, co wyrażało się spadkiem wiremii i całkowitą ochroną zwierząt przed śmiercią. Perspektywa zastosowania siRNA w leczeniu zakażeń wirusowych budzi dziś duże nadzieje, zwłaszcza w aspekcie możliwości użycia koktajli siRNA w połączeniu z innymi preparatami np. immunoglobulinami (Geisbert i wsp. 2006). W kolejnych badaniach Geisbert i wsp. (2010) badali siRNA ukierunkowane na polimerazę L, wirusowe białko 24 (VP24) i VP 35 wirusa ZEBOV dla określenia jego aktywności przeciwwirusowej. Wykorzystując SNALPs, pulę siRNA podano małpom (Rhesus macaques) w dawce 2 mg/kg, przy czym pierwsza grupa zwierząt otrzymywała preparat po 30 min od infekcji, a następnie po upływie 1, 3 i 5 dni. Zaobserwowano 66 % przeżywalności zwierząt. W drugiej grupie, która otrzymywała siedem dawek puli siRNA – po 30 min od infekcji i codziennie przez 6 dni przeżywalność zwierząt wyniosła 100 %. W świetle tych badań siRNA może być efektywną, przeciwwirusową strategią leczenia poekspozycyjnego.

Fowler i wsp. (2005) wykorzystali zjawisko interferencji RNA w celu wyciszania ekspresji genów, kodujących trzy białka strukturalne: NP, VP35 i VP30, które tworzą nukleokapsyd wirusa Marburg (MARV). Doświadczenia przeprowadzono in vitro na komórkach  HeLa i Vero. Małym interferującym RNA, homologicznym do trzech transkryptów (NP, VP30, VP35) kotransfekowano komórki wraz z plazmidem kodującym odpowiednie białka nukleokapsydu, a następnie określano poziom ich syntezy. Zaobserwowano znaczną redukcję poziomu wszystkich trzech białek i  zmniejszenie liczby uwalnianych wirionów potomnych.

Enterlein i wsp. (2006) badali pod kątem aktywności przeciwwirusowej PMO (oligomerów morfolinowych) wobec wirusa Ebola. Związki te są analogami jednoniciowego DNA, zmodyfikowanymi w ten sposób, że podjednostki zawierają pierścień morfolinowy i łączą je inne wiązania niż w kwasach nukleinowych. Na zasadzie komplementarności łączą się one z miejscami inicjacji translacji mRNA, blokując rozpoczęcie tego procesu. Dla zwiększenia szansy wniknięcia PMO do komórki skoniugowano je z bogatymi w argininę peptydami (P-PMO). Użyte do badań PMO i P-PMO zostały zaprojektowane dla 6 sekwencji sensownego lub antysensownego RNA ZEBOV. Zarówno połączone z peptydami, jak i wolne PMO badano przesiewowo w kierunku aktywności przeciwwirusowej in vitro, a po wyselekcjonowaniu najskuteczniejszego z nich, poddawano go badaniom na myszach. Stwierdzono, że P-PMO specyficzne dla sekwencji VP35 hamowało replikację wirusa w hodowli komórkowej i zwiększyło przeżywalność zakażonych zwierząt, zarówno gdy podawano je profilaktycznie jak i leczniczo. Nieskoniugowane z peptydami PMO wykazywały także aktywność profilaktyczną u myszy, co dowodzi że oligomery mogą być nową strategią w profilaktyce i terapii EBOV. Dodatnio naładowane PMO (PMOplus) wykazywały w badaniach poekspozycyjne właściwości ochronne u małp zakażonych wirusami Ebola i Marburg (Warren i wsp. 2010), co stanowi bardzo obiecujący przykład zastosowania zaawansowanej antysensownych rozwiązań protekcyjnych w przypadku narażenia na kontakt z groźnymi filowirusami. 

Takada i wsp. (2007) oceniali skuteczność dwóch neutralizujących przeciwciał monoklonalnych, specyficznych do ZEBOV GP, których epitopy zlokalizowane są w stosunkowo konserwatywnym regionie GP. Myszy, którym podano przeciwciała na drugi dzień po zakażeniu były niewrażliwe na infekcję, podczas gdy zwierzęta leczone po 3 i 4 dniach były tylko częściowo chronione (Takada i wsp. 2007). Wczesne leczenie humanizowanymi nautralizującymi przeciwciałami monoklonalnymi może być efektywną strategią walki z zakażeniami wirusem Ebola.

W zwalczaniu objawów gorączki Zachodniego Nilu wysoką skuteczność wykazują humanizowane przeciwciała gryzoni Hu-E16, skierowane na wysoce konserwatywną domenę III białka otoczkowego WNV. Mimo że terapia przeciwciałami jest obiecująca, możliwości ich szerokiego zastosowania są ograniczone wysokimi kosztami produkcji. W celu ich obniżenia opracowano (Lai i wsp. 2010) metodę produkcji przeciwciał w modyfikowanym genetycznie tytoniu Nicotiana benthamiana, a otrzymane przeciwciała wykazywały identyczną aktywność do tych, które uzyskiwano na zwierzętach, przy znacznym obniżeniu kosztów produkcji.

Infekcja wirusem rozpoczyna się od wniknięcia cząstek wirusa do endosomów komórkowych, przy czym za fuzję wirusa z błoną komórek gospodarza odpowiada glikoproteina otoczki wirusowej (GP). Miller i wsp. (2011) badali peptydy, które efektywnie hamowały wejście wirusa Ebola do komórek, dzięki oddziaływaniu na GP-proteinę wirusa, przy czym największą aktywność zaobserwowano, gdy komórki Vero traktowano peptydem na 30-60 min przed zakażeniem.

W leczeniu zakażeń wywołanych wirusem Ebola zastosowano innowacyjną strategię, polegającą na oddziaływaniu na proces chorobowy a nie replikację wirusa (Geisbert i wsp. 2003). Z uwagi na to, że u naczelnych zakażenie wirusem Ebola indukuje nadekspresję prokoagulanta w monocytach i makrofagach sądzono, że inhibicja szlaku czynnika krzepliwości może złagodzić skutki zakażenia EBOV. Zakażonym zwierzętom podawano w tym celu rekombinowane białko przeciwzakrzepowe nicieni – c2 (rNAPc2), będące silnym inhibitorem czynnika tkankowego inicjującego krzepnięcie krwi. W doświadczeniach na małpach, którym podano c2 w 10 min po zakażeniu (pierwsza grupa) i 24 h po zakażeniu (druga grupa), zaobserwowano, że czas przeżycia zwierząt w obydwu grupach wydłużył się o 33 %.

Carette i wsp. (2011) zidentyfikowali białko komórkowe, pełniące kluczową rolę podczas infekcji wirusem Ebola, tzw. białko Niemanna-Picka C1 (NPC1). Zlokalizowane jest ono w błonie lizosomów, uczestniczy w transporcie cholesterolu i pośredniczy w ,,ucieczce” wirusów z lizosomów do cytoplazmy. Brak tego białka spowodowany mutacją genów powoduje rzadką chorobę zwyrodnieniową, zwaną chorobą Niemanna-Picka. Większość zakażonych dawką śmiertelną wirusa Ebola myszy z mutacją NPC1 przeżywało infekcję, podobnie jak i komórki fibroblastów pochodzące od osób cierpiących na tę chorobę. Badania z wykorzystaniem innych modeli wirusów wykazały, że tylko wirusy Ebola i Marburg wymagają NPC1 do zakażenia. Odkrycie to otwiera zupełnie nowe perspektywy w leczeniu gorączek krwotocznych (Carette i wsp. 2011).

Informacje bibliograficzne do oryginalnego artukułu

Justyna Joniec, Marcin Kołodziej, Michał Bartoszcze, Janusz Kocik, Józef Knap
Research on prevention and treatment of hemorrhagic fevers [w:]
Annals of Agricultural and Environmental Medicine 2012, Vol 19, No 2, 247-253